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一种五元瓜环
—
三聚茚衍生物的多功能荧光探针的制备及应用
技术领域
1.本发明涉及一种荧光探针，特别是一种五元瓜环—三聚茚衍生物的多功能荧光探针的制备及应用。
背景技术：
2.瓜环，亦称葫芦脲(cucurbit[n]urils，q[n]s或cb[n])s)以其特殊的结构特征，即由2n个桥联亚甲基连接n个苷脲形成的具有一个能包结不同客体分子的空腔和两个布满具有与金属离子配位羰基氧原子的端口大环化合物。
[0003]
瓜环在荧光检测方面的应用，目前有直接法和竞争法两种。直接法是利用客体分子进入瓜环空腔后限制客体分子的转动使得客体分子的荧光增强而建立的一种分析方法，可检测的物质有小檗碱、巴马丁等，这一方法可检测的物质种类较少。大多数检测方法还是利用竞争的原理，即利用瓜环和合适的染料预先组装成荧光探针，依据待测分子和染料分子间的竞争作用导致探针荧光猝灭的方式来检测一系列的化合物。这种方法有很大的局限性即如果客体分子竞争不过染料分子，那么就不能导致探针荧光淬灭的发生，限制了该方法的检测应用范围，而且这样的方法不能检测金属离子。
[0004]
针对瓜环在荧光检测应用方面存在的缺陷，考虑用荧光基团修饰瓜环使其具有荧光特性，达到直接检测的目的。三聚茚分子是由三个芴共用中间的一个苯环，从而形成具有y型结构的稠环化合物，具有良好的刚性平面和大的π电子离域性质。三聚茚的c2，c5，c7，c10，c12，c15等多个位点容易被修饰，通过引入不同端基官能团得到π电子体系扩展的三聚茚衍生物，从而得到相应的理化性能。这种以三聚茚为中心点呈放射状延伸出三条线性链的分子呈星型结构。整个分子在空间朝各个方向伸展，避免了分子在空间的重叠，能最大程度的阻止分子间堆积，有效抑制荧光的淬灭。因此在瓜环分子上可通过修饰三聚茚衍生物荧光基团合成出一种新型的荧光探针。在该探针中，三聚茚衍生物做为荧光基团，而瓜环作为与目标物作用的识别基团。当探针与目标物发生作用后可导致探针结构的改变而引起光物理性能的改变。这种探针的响应具有多重性，也就是只要能与瓜环发生主客体相互作用的物质都能引起探针结构的改变进而影响探针的荧光强度。基于此原理，本发明设计了一种五元瓜环-三聚茚衍生物荧光探针，利用五元瓜环对金属离子的识别作用，该探针可以检测多种金属离子，具有多重响应的特点，克服了现有很多探针单一化检测的缺点，达到探针多功能化的目的。
技术实现要素：
[0005]
本发明的目的在于合成一种五元瓜环-三聚茚衍生物荧光探针，五元瓜环利用其空腔和端口的羰基基团对金属离子进行识别，而三聚茚衍生物则作为荧光基团。当探针与金属离子发生作用后，探针结构的改变会引起荧光强度的改变并据此建立相应的检测方法。该探针具有多功能检测的特点，可对cu
2+
,pb
2+
,fe
3+
,fe
2+
, ag
+
五种金属离子进行检测，
检测限可达10-7-10-8
mol/l。
[0006]
本发明合成的荧光探针具有多重响应的功能，可对多种金属离子进行检测，克服了目前许多探针检测单一的缺点，即一种探针只能检测一种金属离子。以该探针建立的金属离子的检测方法表现出线性范围宽、检测限低、精密度和准确度好的特点，可满足实际样品中痕量金属离子的检测要求。
[0007]
本发明的技术方案：
[0008]
一种五元瓜环—三聚茚衍生物的多功能荧光探针的制备及应用，所述探针是利用五元瓜环对金属离子的识别作用，由三聚茚衍生物做为荧光基团，瓜环作为与金属离子作用的识别基团，探针与金属离子发生作用后可导致探针结构的改变而引起光物理性能的改变。
[0009]
前述一种五元瓜环—三聚茚衍生物的多功能荧光探针的制备方法，所述探针的制备方法具体包括以下步骤：
[0010]
(1)取120ml冰醋酸和60ml浓盐酸混合，得到混合溶液，即得a品；
[0011]
(2)准确称取一定量的1-茚酮，将其加入到混合溶液a中，溶解后置于恒温油浴锅中，缓慢升温至120℃，保持此温度回流24h，反应结束后趁热将反应产物迅速倒入冰水混合溶液中，边加边快速搅拌，待均匀分布后，加入无水碳酸钠，边加边搅拌，溶液呈中性后静置，待黄色产物析出完全，减压抽滤后得到的黄色沉淀，先用二次水反复清洗后，再使用丙酮、二氯甲烷反复清洗至沉淀呈淡黄色，在红外干燥箱中干燥后得到三聚茚，即得b品；
[0012]
(3)准确称取上述一定量的b品，加入到50ml的两口圆底烧瓶中，加入无水四氢呋喃，氮气保护的条件下将两口圆底烧瓶置于冰水混合溶液下搅拌，当圆底烧瓶内的温度达到0℃，取正丁基锂，缓慢逐滴加入到两口圆底烧瓶中，在 0℃下反应2h，得c品；
[0013]
(4)取1,6-二溴己烷缓慢逐滴注入c品中，移除冰水混合溶液后于室温下持续搅拌反应12h后，倒入饱和氯化铵溶液以猝灭反应，再用适量二氯甲烷反复萃取三次，并收集有机相，向有机相中加入适量无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，滤液减压浓缩后，得到d品；
[0014]
(5)以硅胶为固定相，石油醚和二氯甲烷的混合溶剂为洗脱剂，分离上述 d品，采用薄层色谱对洗脱下来的洗脱液进行组分追踪，并收集只含5-溴代己基三聚茚的洗脱液，洗脱液经减压浓缩真空干燥后可得5-溴代己基三聚茚目标产物，即得e品；
[0015]
(6)准确称取一定量的单羟基取代五元瓜环((ho)1q[5])加入到50ml的两口圆底烧瓶中，向烧瓶里先加入无水n,n-二甲基甲酰胺，持续搅拌并向悬浮反应液中缓慢注入无水二甲基亚砜，在氮气保护的条件下将两口圆底烧瓶置于冰水混合溶液中，温度降至0℃后，加入氢化钠，搅拌下反应2h，得到f品；
[0016]
(7)向f品中加入一定量的e品，移除冰水混合溶液，室温下持续搅拌反应16h，反应结束后加入乙醚沉淀反应溶液，静置后过滤，收集固体，用适量的甲醇反复多次清洗固体，红外干燥箱中干燥后得棕黄色目标产物，即得荧光探针。
[0017]
具体的说，前述的荧光探针的制备方法，所述步骤(2)中：准确称取20.0g 的1-茚酮，将其加入到混合溶液a中，溶解后置于恒温油浴锅中，缓慢升温至 120℃，保持此温度回流24h，反应结束后趁热将反应产物迅速倒入1l冰水混合溶液中，边加边快速搅拌，待均匀分布后，加入无水碳酸钠，边加边搅拌，溶液呈中性后静置，待黄色产物析出完全，减压抽滤
后得到的黄色沉淀，先用二次水反复清洗后，再使用丙酮、二氯甲烷反复清洗至沉淀呈淡黄色，在红外干燥箱中干燥后得到三聚茚，即得b品。
[0018]
具体的说，前述的荧光探针的制备方法，所述步骤(3)中：准确称取0.732 g的b品，加入到50ml的两口圆底烧瓶中，加入无水四氢呋喃，氮气保护的条件下将两口圆底烧瓶置于冰水混合物中搅拌，当圆底烧瓶内的温度达到0℃，取 4.53ml正丁基锂，缓慢逐滴加入到两口圆底烧瓶中，在0℃下反应2h，得c品。
[0019]
具体的说，前述的荧光探针的制备方法，所述步骤(4)中：取1.3ml的1,6
‑ꢀ
二溴己烷缓慢逐滴注入c品中，移除冰水混合溶液于室温下持续搅拌反应12h 后，倒入饱和氯化铵溶液以猝灭反应，再用适量二氯甲烷反复萃取三次，并收集有机相，向有机相中加入适量无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，滤液减压浓缩后，得到d品。
[0020]
具体的说，前述的荧光探针的制备方法，所述步骤(5)中：固体用硅胶为 200～300目，石油醚和二氯甲烷的比列为1ml:10ml为洗脱液对d品进行分离。根据薄层色谱对洗脱下来的洗脱液进行组分追踪，并收集只含5-溴代己基三聚茚的洗脱液，洗脱液经减压浓缩真空干燥后可得5-溴代己基三聚茚目标产物，即得 e品。
[0021]
具体的说，前述的荧光探针的制备方法，所述步骤(6)中：准确称取80mg 的单羟基取代五元瓜环((ho)1q[5])加入到50ml的两口圆底烧瓶中，向烧瓶里先加入2ml无水n,n-二甲基甲酰胺，持续搅拌并向悬浮反应液中缓慢注入7ml 无水二甲基亚砜，在氮气保护的条件下将两口圆底烧瓶置于冰水混合溶液中，温度降至0℃后，加入272mg氢化钠，搅拌下反应2h，得到f品。
[0022]
具体的说，前述的荧光探针的制备方法，所述步骤(7)中：向f品中加入 80mg的e品，移除冰水混合溶液，室温下持续搅拌反应16h，反应结束后加入60ml乙醚沉淀反应溶液，静置后过滤，收集固体，用适量的甲醇反复多次清洗固体，红外干燥箱中干燥后得棕黄色目标产物，即得荧光探针。
[0023]
前述一种五元瓜环—三聚茚衍生物的多功能荧光探针应用，所述荧光探针检测方法是荧光探针在n,n-二甲基甲酰胺-水混合溶剂中，用荧光光谱仪测定探针对金属离子的荧光响应。电压设置为600v，激发波长为296nm，激发狭缝5nm，发射狭缝5nm，测定荧光探针分别与金属离子发生作用后，在382nm的荧光发射波长下荧光强度的减弱程度，根据荧光强度的减弱可分别建立其相应离子的检测方法。
[0024]
具体的说，前述应用，所述n,n-二甲基甲酰胺-水混合溶剂，按照体积比， n,n-二甲基甲酰胺：水＝8：2，n,n-二甲基甲酰胺-水混合溶剂的ph＝7，金属离子为cu
2+
，pb
2+
，fe
2+
，fe
3+
，ag
+
。
附图说明：
[0025]
图1三聚茚的合成路线；
[0026]
图25-溴代己基三聚茚的合成路线；
[0027]
图3五元瓜环-三聚茚衍生物的合成路线；
[0028]
图41.0
×
10-5
mol/l的q[5]-tr探针在dmf/h2o(v/v，8/2)溶液中与不同金属离子作用的荧光光谱图(金属离子有：cu
2+
，pb
2+
，fe
2+
，fe
3+
，ag
+
，sr
2+
， mn
2+
，hg
2+
，k
+
，co
2+
，na
+
，mg
2+
，la
3+
，zn
2+
，ni
2+
，li
+
，cr
3+
，cd
2+
；图(a)：q[5]-tr，b：q[5]-tr+cu
2+
，c：q[5]-tr+fe
3+
)。
具体实施方式
[0029]
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
[0030]
实施例1：
[0031]
1、制作方法：
[0032]
(1)三聚茚的合成：取120ml冰醋酸和60ml浓盐酸混合，得到混合溶液，即得a品；准确称取20.0g的1-茚酮，将其加入到混合溶液a中，溶解后置于恒温油浴锅中，缓慢升温至120℃，保持此温度回流24h，反应结束后趁热将反应产物迅速倒入1l冰水混合物中，边加边快速搅拌，待均匀分布后，加入无水碳酸钠，边加边搅拌，溶液呈中性后静置，待黄色产物析出完全，减压抽滤后得到的黄色沉淀，先用二次水反复清洗后，再使用丙酮、二氯甲烷反复清洗至沉淀呈淡黄色，红外干燥箱中干燥后得到三聚茚，即得b品。
[0033]
(2)5-溴代己基三聚茚的合成：准确称取0.732g的b品，加入到50ml 的两口圆底烧瓶中，加入无水四氢呋喃，氮气保护的条件下将两口圆底烧瓶置于冰水混合溶液中搅拌，当圆底烧瓶内的温度达到0℃，取4.53ml正丁基锂，缓慢逐滴加入到两口圆底烧瓶中，在0℃下反应2h，得c品；取1.3ml的1,6-二溴己烷缓慢逐滴注入c品中，移除冰水混合溶液，室温下持续搅拌反应12h后，倒入饱和氯化铵溶液以猝灭反应，再用适量二氯甲烷反复萃取三次，并收集有机相，向有机相中加入适量无水硫酸钠进行干燥，过滤，收集滤液，滤液减压浓缩后，得到d品；以200～300目的硅胶为固定相，石油醚和二氯甲烷＝1ml:10ml的混合溶剂为洗脱剂，分离上述d品，根据薄层色谱对洗脱下来的洗脱液进行组分追踪，并收集只含5-溴代己基三聚茚的洗脱液，洗脱液经减压浓缩真空干燥后可得5-溴代己基三聚茚目标产物，即得e品。
[0034]
(3)五元瓜环-三聚茚衍生物(q[5]-tr)的合成：准确称取80mg的单羟基取代五元瓜环((ho)1q[5])加入到50ml的两口圆底烧瓶中，向烧瓶里先加入 2ml无水n,n-二甲基甲酰胺，持续搅拌并向悬浮反应液中缓慢注入7ml无水二甲基亚砜，在氮气保护的条件下将两口圆底烧瓶置于冰水混合溶液中，温度降至 0℃后，加入272mg氢化钠，搅拌下反应2h，得到f品；向f品中加入80mg的 e品，移除冰水混合溶液后于室温下持续搅拌反应16h，反应结束后加入60ml 乙醚沉淀反应溶液，静置后过滤，收集固体，用适量的甲醇反复多次清洗固体，红外干燥箱中干燥后得棕黄色目标产物，即得荧光探针。
[0035]
检测方法：用分析天平准确称取q[5]-tr荧光探针1.27mg，用n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶解，配制成浓度为1.0
×
10-4
mol/l的探针溶液。采集500ml的花溪河河水(中国贵州贵阳)置于烧杯中，静置放置12小时以去除河水中的泥沙，用孔径大小为0.22μm的水相滤膜过滤上层河水，去除河水中的悬浮颗粒，用naoh调节河水的酸碱性，使其ph＝7。精密量取8ml探针溶液和2ml水样溶液于10ml具塞离心试管中，混合均匀后室温下放置3min,用荧光光谱仪进行测定。电压设置为600v，激发波长为296nm，激发狭缝5nm，发射狭缝5nm，测定荧光探针在382nm的荧光发射波长下的荧光强度。
[0036]
为验证本发明的有益效果，发明人进行了大量的实验研究，实验过程和结果如下：
[0037]
一、实验仪器及试药试剂
[0038]
1、仪器
[0039]
cary eclipse荧光光谱仪(美国，agilent公司)，hx501t电子天平(慈溪市天东衡器厂)，csf-1a超声波发生器(上海超声波仪器厂)，超纯水机(成都浩康科技有限公司)。
[0040]
2、试药试剂
[0041]
三氯化铁、二氯化铁、硝酸银、三水合硝酸铜、硝酸铅购自北京伊诺凯科技有限公司(分析纯)；n,n-二甲基甲酰胺购自广东光华科技股份有限公司(分析纯)。
[0042]
二、五元瓜环-三聚茚衍生物荧光探针的合成
[0043]
1.三聚茚的合成
[0044]
由1-茚酮经过多次羟醛缩合和脱水反应成环制备三聚茚。准确称取1-茚酮 (20.0g，151mmol)，将其加入到冰醋酸(120ml)和浓盐酸(60ml)的混合溶液中溶解，溶解后置于恒温油浴锅中，缓慢升温至120℃，保持此温度回流 24h，反应结束后趁热将反应产物迅速倒入1l冰水混合溶液中，边倒边快速搅拌，待均匀分布后，加入无水碳酸钠以中和未反应完全的酸，边加边搅拌，溶液呈中性后静置，大概一个小时黄色产物析出完全，减压抽滤后，得到的黄色沉淀先用二次水反复清洗后，再使用丙酮、二氯甲烷反复清洗至沉淀呈淡黄色，红外干燥箱中干燥后得到三聚茚。三聚茚的合成路线可见图1。
[0045]
2.5-溴代己基三聚茚的合成
[0046]
准确称取0.732g(2.4mmol)的三聚茚，加入到50ml的两口圆底烧瓶中，再向圆底烧瓶里加入12ml的无水四氢呋喃，氮气保护的条件下置于冰水混合物中搅拌，当圆底烧瓶内的温度达到0℃，取4.53ml(7.25mmol 1.6m in hexane) 的正丁基锂，缓慢逐滴加入到两口圆底烧瓶中，在0℃下反应2h以后，取1.3ml 的1,6-二溴己烷缓慢逐滴注入反应液中，移除冰水混合溶液于室温下持续搅拌反应12h，反应结束后，向生成物中倒入饱和氯化铵溶液以猝灭反应，用适量二氯甲烷反复萃取三次，并收集有机相，向有机相中加入适量无水硫酸钠对其进行干燥，滤纸过滤除去固体。滤液减压浓缩后得到的固体用硅胶(200-300目)为固定相，石油醚和二氯甲烷的混合溶剂为洗脱剂(1:10，v/v)分离，根据薄层色谱对洗脱下来的洗脱液进行组分追踪，并收集只含5-溴代己基三聚茚的洗脱液，洗脱液经减压浓缩真空干燥后可得5-溴代己基三聚茚。5-溴代己基三聚茚的合成路线可见图2。
[0047]
3.五元瓜环-三聚茚衍生物(q[5]-tr)的合成
[0048]
准确称取80mg的单羟基取代五元瓜环((ho)1q[5])加入到50ml的两口圆底烧瓶中，向烧瓶里先加入2ml无水n,n-二甲基甲酰胺，持续搅拌并向悬浮反应液中缓慢注入7ml无水二甲基亚砜。在氮气保护的条件下将两口圆底烧瓶置于冰水混合溶液中，温度降至0℃后，向反应液中加入272mg(9.14mol)氢化钠，搅拌下反应2h，随后向反应液中加入80mg的5-溴代己基三聚茚，移除冰水混合溶液后于室温下持续搅拌反应16h。反应结束后，向反应液中加入 60ml的乙醚沉淀反应溶液，静置后过滤，收集固体，用适量的甲醇反复多次清洗固体，红外干燥箱中干燥后得棕黄色目标产物。五元瓜环-三聚茚衍生物的合成路线见图3。
[0049]
三、合成的五元瓜环-三聚茚衍生物荧光探针对金属离子cu
2+
，pb
2+
，fe
2+
， fe
3+
，ag
+
的检测
[0050]
1、检测方法
[0051]
合成的五元瓜环-三聚茚衍生物荧光探针在n,n-二甲基甲酰胺(dmf)-水混合溶剂中(v/v，8/2，ph＝7)，分别与金属离子cu
2+
，pb
2+
，fe
2+
，fe
3+
，ag
+
发生作用后，其体系在382nm的荧光发射波长下荧光强度都有不同程度的减弱(荧光强度的减弱范围在219～88)(图4)，因此根据荧光强度的减弱可分别建立其相应离子的检测方法。
[0052]
2、检测步骤
[0053]
在dmf/h2o(v/v，8/2，ph＝7)溶液中研究探针q[5]-tr与cu
2+
，pb
2+
，fe
2+
， fe
3+
，ag
+
的线性关系。首先测试浓度范围为1.0
×
10-9
mol/l～2.0
×
10-5
mol/l的8 个探针溶液在382nm发射波长下的荧光强度。然后向各浓度的探针溶液中分别加入同浓度的不同金属离子cu
2+
、pb
2+
、fe
2+
、fe
3+
和ag
+
，混合均匀后室温放置 3min，于382nm发射波长下测定体系的荧光强度。由于探针与金属离子作用后，探针的结构发生变化从而导致荧光强度发生变化。荧光强度的变化值δf＝f
探针
—f
探针+金属离子
与金属离子的浓度呈线性关系，因此可对金属离子进行定量检测。荧光测试条件为电压600v，激发波长为296nm，发射波长382nm,，激发狭缝5nm，发射狭缝5nm。
[0054]
3、检测结果
[0055]
cu
2+
检测的线性范围在1.0
×
10-7
mol/l～1.0
×
10-5
mol/l之间，检测限为 2.5
×
10-8
mol/l；pb
2+
检测的线性范围在5.0
×
10-8
mol/l～8.0
×
10-6
mol/l之间，检测限为2.3
×
10-8
mol/l；fe
3+
检测的线性范围在5.0
×
10-7
mol/l～2.0
×
10-5
mol/l 之间，检测限为5.4
×
10-8
mol/l。fe
2+
检测的线性范围在1.0
×
10-7
mol/l～1.0
×
10-5 mol/l之间，检测限为4.9
×
10-8
mol/l；ag+检测的线性范围在5.0
×
10-7
mol/l～ 2.0
×
10-5
mol/l之间，检测限为1.2
×
10-7
mol/l。
[0056]
四、实际水样的测定
[0057]
1、检测步骤
[0058]
用分析天平准确称取q[5]-tr荧光探针1.27mg，用n,n-二甲基甲酰胺(dmf) 溶解，配制成浓度为1.0
×
10-4
mol/l的探针溶液。采集500ml的花溪河河水(中国贵州贵阳)置于烧杯中，静置放置12小时以去除河水中的泥沙，用孔径大小为0.22μm的水相滤膜过滤上层河水，去除河水中的悬浮颗粒，用naoh调节河水的酸碱性，使其ph＝7。精密量取8ml探针溶液和2ml水样溶液于10ml具塞离心试管中，混合均匀后室温下放置3min,用荧光光谱仪进行测定。在水样中分别加入3个浓度范围在1.0
×
10-7
mol/l～2.0
×
10-5
mol/l的不同金属离子cu
2+
、 pb
2+
、fe
2+
、fe
3+
和ag
+
，混合均匀后室温放置3min，于382nm发射波长下测定体系的荧光强度，代入拟合的标准曲线中计算回收率。电压设置为600v，激发波长为296nm，激发狭缝5nm，发射狭缝5nm，测定荧光探针在382nm的荧光发射波长下的荧光强度。
[0059]
2、检测结果
[0060]
用合成的探针对贵阳花溪河的河水进行了检测，没有发现cu
2+
，pb
2+
，fe
2+
， fe
3+
和ag
+
。采用标准加入法在水样中加入不同浓度的cu
2+
，pb
2+
，fe
2+
，fe
3+
， ag
+
，计算该法的回收率，结果如表1所示，金属离子的回收率在76.3％-93.8％之间，rsd％在0.27％-1.10％之间，表现出该探针检测具有良好的精密度和准确度。由此可见，探针q[5]-tr检测cu
2+
，pb
2+
，fe
2+
，fe
3+
，ag
+
的线性范围宽、检出限低、精密度好，是一种简单、方便的方法，可满足实际水样中金属离子的痕量分析。
[0061]
表1水样中金属离子的回收率
[0062][0063]
五、本发明具有的优点
[0064]
1、本发明合成的荧光探针具有多重响应的功能，可对多种金属离子进行检测，克服了目前许多探针检测单一的缺点，即一种探针只能检测一种金属离子。
[0065]
2、以该探针建立的金属离子的检测方法表现出线性范围宽、检测限低、精密度和准确度好的特点，可满足实际样品中痕量金属离子的检测要求。