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背景技术：
2.肝癌在全球范围发病率居所有肿瘤第6位，致死率居第4位，在我国流行情况更加严重，发病率居第4位，致死率居第2位，对社会造成巨大负担。肝癌治疗方法及疗效有限，是制约肝癌预后提高的重要原因。目前肝癌靶向药有索拉非尼（sorafenib）、瑞戈非尼（regorafenib）、仑伐替尼（lenvatinib）、及卡博替尼（cabozantinib）。它们主要作用机制是：肝癌常较周围正常肝组织存在多种酪氨酸激酶通路异常表达活化，上述药物抑制这些酪氨酸激酶通路，从而起到抑制肝癌，而不抑制或轻微抑制周围正常肝组织的作用。但是，肝癌常存在靶向药物抵抗，导致疗效不理想，迫切需要研发一种新的治疗肝癌的药物，进而提高肝癌病人生存率。
技术实现要素：
3.本发明提供了一种icg
‑
β
‑
环糊精载药系统及其制备方法和应用，具体技术方案为：一种icg
‑
β
‑
环糊精载药系统，包括icg
‑
β
‑
环糊精，其结构如式i所示：一种icg
‑
β
‑
环糊精载药系统，采用以下方法制备得到：（1）制备羧基修饰的icg：在乙腈中加入1，1，2
‑
三甲基苯并吲哚和乙基碘，加热回流，真空浓缩，得残留物，向残留物中加入乙醚，得固体，洗涤固体，得化合物1，将化合物1与戊二醛二腈盐酸盐在乙酸酐中加热，冷却后，洗涤产物，得到化合物2；在乙腈中加入1，1，2
‑
三甲基苯并吲哚和6
‑
碘己酸，加热回流，真空浓缩，得残留
物，向残留物中加入乙醚，得固体，洗涤固体，得到化合物3；将化合物2和化合物3在吡啶中反应，去除溶剂，残留物通过硅胶色谱纯化，洗脱得到化合物4，化合物4即为羧基修饰的icg载体，记为icg
‑
cooh；（2）制备氨基修饰的环糊精：首先制备单
‑
（6
‑
氧
‑6‑
对甲苯磺酰基）
‑
β
‑
环糊精，然后制备乙二胺
‑
β
‑
环糊精，记为2n
‑
β
‑
cd；（3）制备超分子药物载体：将icg
‑
cooh溶于二甲基亚砜中，同时加入3倍摩尔量的1
‑
(3
‑
二甲胺基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺/n
‑
羟基琥珀酰亚胺，然后将溶于二甲基亚砜的2n
‑
β
‑
cd加入到上述反应液中，透析后将所得的样品冷冻干燥后得到所述icg
‑
β
‑
环糊精载药系统。
4.本发明还提供了一种药物组合物，以所述的icg
‑
β
‑
环糊精作为药物活性成分在制备靶向肝癌治疗药物上的应用。
5.本发明还提供了一种药物组合物，所述靶向肝癌治疗药物中还包括索拉菲尼和奥沙利铂。
6.吲哚菁绿（indocyanine green，icg）是经美国fda批准可以用于临床近红外光造影剂，在临床上，icg被广泛应用于对肝功能、心输出量、视网膜的脉管系统的辅助诊断。激发波长：760 nm，发射波长：830 nm，属于一种良好的光敏剂，在近红外光照射下，可以吸收光能并将其转化为热能或产生单线态氧发挥肿瘤杀伤作用。
7.icg是一种分子量为775的水溶性分子，具有双重的亲脂、亲水特性，在血液中与血清蛋白（白蛋白和β
‑
脂蛋白）结合，被肝脏摄取，然后以游离形式分泌到胆汁，经肠、粪便排出体外，不参加肝、肠循环与生化转化，也不从肾脏排泄，无毒副作用。近年来icg应用于临床的肝癌荧光显像，在荧光腹腔镜下其可准确地标记肝癌位置，具体机制为：经静脉注射后，icg与血清蛋白结合，进入肝血窦后的icg穿过内皮细胞被肝细胞选择性摄取，然后以游离形式进入胆汁，随即与胆汁中蛋白质结合，当受到波长为750
‑
810nm的光波激发后，会释放出波长大约为830nm的红外光，因而具有荧光特性。正常肝脏组织，吲哚菁绿仅几小时就会完全排泄入胆道，然后经过肝内各级胆管进入胆囊管、胆总管，最后进入肠道，整个过程无中间代谢，也不经历肠肝循环，肝脏表面及胆道的荧光随即消失。
8.然而，当肝脏发生癌变致使肝脏细胞及毛细胆管受损，受损肝组织内肝细胞及毛细胆管细胞的分泌、排泄功能发生障碍，使icg滞留在病变组织内，从而在肝癌组织中积累，可在肝癌滞留1
‑
2周，荧光也因此延迟消失，从而特异性标记出肝癌病变组织，导致病变组织与正常组织形成强烈荧光对比，实时显示出肝脏病灶的位置和大小，因此在肝脏肿瘤外科中体现出了较高的临床应用价值。
9.环糊精（cyclodextrins，cds）是一类环状低聚糖，其结构如图1所示，其中β
‑
cd及其衍生物是最常被使用的一类，其结构类似于一个口宽底窄的圆锥台，里面中空，深度为0.79 nm，直径为0.60
‑
0.65nm，这样形成的空穴恰好可装进其它分子。环糊精的葡萄糖单元的羟基在两端的孔处朝向外侧，而次甲基质子位于腔内，其结构使得环糊精具有亲水性外表和疏水性空腔。其可以与小分子和大部分化合物形成水溶性包合复合物。另外，环糊精在包结过程中构象变化不明显，因此环糊精的主客体包结物不仅能以固体状态存在，在水和某些有机溶剂中也能形成。这一性质是环糊精能被用来研究在生物体中极为重要的增水作用。因此，可以通过在水性条件下的主客体相互作用将各种尺寸匹配的客体包封到空腔中
去。
10.环糊精表现出的良好的水溶性以及生物相容性和对生物系统的无毒性，这些优异特性进一步促进了在生物医学领域使用环糊精的广泛研究。
11.环糊精是研究最早也是最重要的具有报界性能的大环化合物，它的最重要的性质就是包结有机物，这种结合是靠非共价键的相互作用。一般涉及以下几个方面：(1)环糊精与客体之间的范德华力；(2)环糊精的羟基与客体分子间的氢键缔合：(3)环糊精空腔中高能水分子的释放与张力能(构象应变能)的释放；(4)环糊精分子空腔的增水作用；(5)客体分子必须与环糊精空腔的几何形状(尺寸和空间构型相匹配)。
12.大量的研究表明，联合疗法与单药治疗相比，能通过多种机制杀死肿瘤细胞，在增强治疗效果的同时，降低肿瘤耐药性产生的风险。但值得注意的是，在许多 iii 期实验中，联合疗法的疗效却远低于预期。这主要是因为在多种药物的联合疗法中，不同药物只有在特定的比例下才能发挥最大疗效。但在传统联合治疗的给药过程中，由于不同药物间存在药代动力学、组织分布差异，无法保证药物进入人体后在病灶部位达到合适的比例及浓度，极大地限制了治疗效果。因此，研究一种药物递送系统，将多种药物以特定的比例准确递送到肿瘤内发挥协同作用，是增强多种药物联用治疗 hcc 效果的关键。
13.在本发明中利用icg对肝癌特异性标记的特性，将其作为肝癌治疗的靶向引导物质，环糊精为载体，利用环糊精的空腔作用包合难溶性的抗癌药物，两者通过共价键连接起来(icg
‑
cd)，构建基于icg
‑
环糊精超分子体系的肝癌靶向载药体系。可以通过分别制备包载不同药物的载药复合物，同时给予两种复合物联合治疗，从而增强治疗效果。
附图说明
14.图1. β
‑
环糊精的结构；图2. os
‑
icg
‑
β
‑
cd 高效液相谱图：a：icg
‑
β
‑
cd载体；b：奥沙利铂；c：索拉菲尼；图3. oxa的标准曲线；图4. sor的标准曲线；图5. oxa 与 sor 在不同制剂中的体外释放；图6. 小动物活体成像系统检测os
‑
icg
‑
β
‑
cd体内分布情况；图7. os
‑
icg
‑
β
‑
cd靶向抗肿瘤效果；图8. os
‑
icg
‑
β
‑
cd对细胞活度的影响；图9. 细胞摄取药物曲线图。
具体实施方式
15.实施例：在研究中，准确称量一定比例的索拉菲尼、奥沙利铂、icg
‑
β
‑
cd，将其全部溶解于乙醇/水(体积比=1:1:5)的混合溶剂中，室温下避光搅拌。旋转蒸发除去反应液中大部分乙醇后，用微孔滤膜过滤反应液，除去其中未反应的药物。将滤液旋干后放入真空干燥箱中12h，得到icg
‑
环糊精超分子体系搭载难溶性靶向肝癌治疗药物包合物：奥沙利铂
‑
索拉菲尼icg
‑
β
‑
环糊精。同时进行体内药代动力学实验、靶向抗肝癌活性以及细胞体外实验验证其治疗效果。
16.1、icg
‑
β
‑
环糊精的制备方法制备羧基修饰的icg：在乙腈中加入1，1，2
‑
三甲基苯并吲哚和乙基碘，加热回流，真空浓缩，得残留物，向残留物中加入乙醚，得固体，洗涤固体，得化合物1，将化合物1与戊二醛二腈盐酸盐在乙酸酐中加热，冷却后，洗涤产物，得到化合物2；在乙腈中加入1，1，2
‑
三甲基苯并吲哚和6
‑
碘己酸，加热回流，真空浓缩，得残留物，向残留物中加入乙醚，得固体，洗涤固体，得到化合物3；将化合物2和化合物3在吡啶中反应，去除溶剂，残留物通过硅胶色谱纯化，洗脱得到化合物4，化合物4即为羧基修饰的icg载体，记为icg
‑
cooh；制备氨基修饰的环糊精：首先制备单
‑
（6
‑
氧
‑6‑
对甲苯磺酰基）
‑
β
‑
环糊精，然后制备乙二胺
‑
β
‑
环糊精，记为2n
‑
β
‑
cd；制备超分子药物载体：将icg
‑
cooh溶于二甲基亚砜中，同时加入3倍摩尔量的1
‑
(3
‑
二甲胺基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺/n
‑
羟基琥珀酰亚胺，然后将溶于二甲基亚砜的2n
‑
β
‑
cd加入到上述反应液中，透析后将所得的样品冷冻干燥后得到所述超分子药物载体。
17.2、icg
‑
β
‑
环糊精经过制备后，其结构式如式i，下文中用icg
‑
β
‑
cd表示。
18.3、肝靶向奥沙利铂
‑
索拉菲尼icg
‑
β
‑
环糊精载药系统的制备及表征3.1 制备方法：oxa
‑
icg
‑
β
‑
cd：准确称量一定比例的奥沙利铂和icg
‑
β
‑
cd，将其全部溶解于乙醇和水(体积比=1:5)的混合溶剂中，室温下避光搅拌。旋转蒸发除去反应液中大部分乙醇后，用微孔滤膜过滤反应液，除去其中未反应的奥沙利铂。将滤液旋干后放入真空干燥箱中12h，即得oxa
‑
icg
‑
β
‑
cd包合物。
19.sor
‑
icg
‑
β
‑
cd：准确称量一定比例的索拉菲尼和icg
‑
β
‑
cd，将其全部溶解于乙醇和水(体积比=1:5)的混合溶剂中，室温下避光搅拌。旋转蒸发除去反应液中大部分乙醇后，用微孔滤膜过滤反应液，除去其中未反应的索拉菲尼。将滤液旋干后放入真空干燥箱中12h，即得到sor
‑
icg
‑
β
‑
cd包合物。
20.os
‑
icg
‑
β
‑
cd：准确称量一定比例的索拉菲尼和icg
‑
β
‑
cd，将其全部溶解于乙醇和
水(体积比=1:5)的混合溶剂中，室温下避光搅拌。旋转蒸发除去反应液中大部分乙醇后，用微孔滤膜过滤反应液，除去其中未反应的索拉菲尼。将滤液旋干后放入真空干燥箱中12h后，得到sor
‑
icg
‑
β
‑
cd包合物。将sor
‑
icg
‑
β
‑
cd包合物与奥沙利铂以一定的比例溶解于乙醇/水(体积比=1:5)的混合溶剂中，室温下避光搅拌。旋转蒸发除去反应液中大部分乙醇后，用微孔滤膜过滤反应液，除去其中未反应的奥沙利铂。将滤液旋干后放入真空干燥箱中12h，即得os
‑
icg
‑
β
‑
cd包合物。
21.free oxa
‑ꢀ
sor：即奥沙利铂与索拉菲尼的混合溶液。
22.3.2 os
‑
icg
‑
β
‑
cd中奥沙利铂、索拉菲尼含量测定方法的建立3.2.1 色谱条件专属性的考察色谱条件色谱柱：c18柱；流动相：甲醇
‑
水（10:90，v/v）；流速：1.0 ml/min；检测波长：250 nm；进样量：20 μl，柱温：25℃。结果如图2所示。
23.3.2.2 标准曲线的制备：奥沙利铂标准曲线的建立奥沙利铂标准液的配制：精密称取奥沙利铂 1 mg，置于 25 ml 的容量瓶中，加入流动相溶解并稀释至刻度线，摇匀，得到浓度为 40 μg/ml 的奥沙利铂标准液。
24.然后配置不同浓度梯度的奥沙利铂溶液。精密量取奥沙利铂标准液 3.5 ml，3.0 ml，2.5 ml，2.0 ml，1.5 ml，1.0 ml，0.5 ml 分别置于 5 ml 容量瓶中，加入流动相溶解稀释至刻度线，摇匀，得到浓度分别为 28 μg/ml，24 μg/ml，20 μg/ml，16 μg/ml，12 μg/ml，8 μg/ml，4 μg/ml 的奥沙利铂溶液。hplc检测，记录峰面积（a），并绘制纵坐标为峰面积（a），横坐标为奥沙利铂浓度（c）的标准曲线,（图3）。
25.表1 hplc测定不同浓度奥沙利铂溶液的峰面积（n=3）索拉菲尼标准曲线的建立精密称取索拉菲尼 4.0 mg，置于 100 ml 容量瓶中，加入无水甲醇稀释至刻度线，摇匀，配置得到浓度为 40 μg/ml的索拉菲尼标准液。
26.然后配置不同浓度梯度的索拉菲尼溶液：用流动相稀释成浓度依次为0.05μg/ml，0.10μg/ml，0.25μg/ml，0.5μg/ml，1.0μg/ml，2.5μg/ml，5.0μg/ml，10μg/ml的标准应用液(临用时稀释)。hplc检测，记录峰面积（a），并绘制纵坐标为峰面积（a），横坐标为索拉菲尼浓度（c）的标准曲线（图4）。
27.表2 hplc测定不同浓度奥沙利铂溶液的峰面积（n=3）3.4包封率测定：采用离心
‑
透析法除去未被包封的游离药物测定os
‑
icg
‑
β
‑
cd的包封率，具体操作
如下：取适量 os
‑
icg
‑
β
‑
cd溶液，在 5000 rpm 的转速下离心 5 min，得到的上清液用 0.22 μm 的滤膜过滤，从而去除未被包裹的sor。然后将上清液置于透析袋（截留分子量 8000
‑
14000 da）中，用 pbs 缓冲液（0.01m，ph7.4）透析过夜，去除游离的 oxa。将纯化后的os
‑
icg
‑
β
‑
cd按标准曲线绘制中的方法，用 hplc 法测定os
‑
icg
‑
β
‑
cd中包封的 oxa 与 sor 含量。药物的包封率（dee）和载药量（dle）分别按如下公式计算：dee(%) =(载药平台中包封的药物/投药量)
×ꢀ
100%dle(%) =(载药平台中包封的药物/(载药平台中包封的药物 + 载药平台))
×ꢀ
100%表 3. os
‑
icg
‑
β
‑
cd中 oxa 与 sor 的包封率及摩尔比例3.5 os
‑
icg
‑
β
‑
cd体外释放测定：利用透析法测定os
‑
icg
‑
β
‑
cd中 oxa 与 sor 的体外释放速率，具体操作如下：首先取 2 ml 样品溶液加入到透析袋（截留分子量 8000
‑
14000 da）内，然后将透析袋置于 20 ml 含有 0.05% tween 80（v/v）的 pbs 溶液中（0.01 m，ph 7.4），在 37℃条件下，以 100 rpm 的振荡。在 0.5 h，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h，48 h 分别取透析袋外的释放介质 1 ml，同时向透析袋外补充相同温度、体积的空白释放介质。所取样品溶液在经 0.45 μm 滤膜过滤后，按oxa 与 sor 标准曲线绘制的方法，利用 hplc法测定其中 oxa 与sor 的含量。所有测量一式三份（图5）。
28.4、os
‑
icg
‑
β
‑
cd 体内评价icg
‑
β
‑
环糊精，利用icg的靶向作用，对比常规用药方式，对正常肝组织细胞的毒副作用，以及对药液途径上的正常器官，其药液浓度及毒副作用数据。
29.4.1 药代动力学通过将icg
‑
β
‑
环糊精作为载药平台，负载靶向治疗肝癌的药物索拉菲尼，通过尾静脉给药方式注射至小鼠体内（使用索拉菲尼药物采用灌胃方法进行给药），验证icg
‑
β
‑
环糊精对正常肝组织细胞的毒副作用，以及对药液途径上的正常器官，其药液浓度及毒副作用。采用小动物活体成像考察icg
‑
β
‑
cd载药系统在动物体内的组织分布。
30.4周龄icr小鼠，体重18
‑
22g，雌雄各半，每组10只。分别在给药0.5h，1h，2h，4h，8h后，使用异氟烷对小鼠进行麻醉，并利用ivis spectrum近红外荧光成像仪对小鼠进行扫描，设定激发波长为760nm，发射波长为830nm。使用living image软件对相关图像进行分析处理，检测肝脏的荧光信号（图6）。
31.4.2、icg
‑
β
‑
环糊精载药系统治疗效果。
32.icg
‑
β
‑
环糊精作为载药平台，在肝癌细胞内的药液浓度，持续时间，浓度变化规律，深层次的肝癌细胞内是否能够实现给药，即实现给药深度的提高。
33.实验分组：(1) 原位移植瘤(2) 原位移植瘤+奥沙利铂(3) 原位移植瘤+索拉菲尼
(4) 原位移植瘤+os
‑
icg
‑
β
‑
cd裸鼠皮下成瘤：体外培养人肝癌细胞hep3b，收集对数生长期的细胞制成悬液，接种于裸鼠背部皮下，每只裸鼠注射细胞混悬液0.2ml，含细胞数2
×
106，继续常规饲养，待肿瘤直径达1.0cm时，麻醉裸鼠，无菌条件下取出肿瘤，用眼科剪将肿瘤组织剪切成1mm3小瘤块，置于无血清dmem培养基备用。
34.原位移植瘤的建立：无菌条件下，麻醉裸鼠，腹部正中横切口暴露肝脏，用10ml注射器针头做1个深1~2mm的隧道，将肿瘤组织碎片移植到隧道内，明胶海绵压迫止血后全层关腹。依次缝合小鼠皮下层、皮层，解绑小鼠，移至放置垫料的鼠笼，使其侧躺，并覆予棉花。
35.次日，将小鼠随机分组并给予食物、水。接种次日，开始给药。将小鼠随机分四组，每组6只。给药于期间注意观察裸鼠饮食、饮水、体重、皮毛光泽度和脱落等情况等一般情况。
36.给药浓度及方式：将icg
‑
β
‑
cd及制备的复合物配置成30μg/ml的浓度，经尾静脉注射0.2ml注入小鼠体内，检测小鼠移植瘤体的大小观察治疗效果（图7）。
37.5、os
‑
icg
‑
β
‑
cd 体外评价本部分主要对肝靶向奥沙利铂与索拉菲尼共载icg
‑
β
‑
cd的体外抗肿瘤活性进行研究。以人肝癌 hepg2 细胞为研究对象，通过 cck
‑
8 法考察os
‑
icg
‑
β
‑
cd对肿瘤细胞活度抑制效果。并利用hplc分析细胞对不同药物的摄取曲线。
38.细胞培养：hepg2 使用含有 10%胎牛血清的高糖 dmem 培养基，置于 37℃、5% co2的细胞培养箱中培养。
39.5.1 cck
‑
8 法检测os
‑
icg
‑
β
‑
cd的体外细胞毒性实验分组：(1) hepg2细胞(2) hepg2细胞+ icg
‑
β
‑
cd(3) hepg2细胞+索拉菲尼(4) hepg2细胞+奥沙利铂(5) hepg2细胞+索拉菲尼+索拉菲尼(6) hepg2细胞+ os
‑
icg
‑
β
‑
cd首先将 hepg2 细胞接种（约 5
×
103个/孔）至 96 孔板中，培养 24 h。然后加入一定不同的药物制剂，每组5个复孔。加样孵育 48 h 后，用 cck
‑
8 法检测细胞活性。
40.具体操作如下：首先，移除96 孔板中原有的培养基，加入 200 μl 含有 10% （v/v）cck
‑
8 试剂的新鲜培养基，并在 37℃条件下孵育 2 h。然后，移除含有 cck
‑
8 的培养基，并用无菌 pbs溶液洗涤 3 次。使用酶标仪测定在波长 450nm 处每个孔的吸光度值（a），根据所测得的吸光度计算得到相应的细胞存活率（图8）。
41.5.2 体外摄取药物试验实验分组(1) hepg2细胞+索拉菲尼(2) hepg2细胞+奥沙利铂(3) hepg2细胞+奥沙利铂+索拉菲尼(4) hepg2细胞+ os
‑
icg
‑
β
‑
cd
将 hepg2 细胞接种（约 5
×
103个/孔）至 96 孔板中，培养 24 h。然后加入一定不同的药物制剂，每组5个复孔，在 0.5 h，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h，48 h ，72h分别收集细胞，制备匀浆液，离心取上清后，所取样品溶液在经 0.45 μm 滤膜过滤后，按oxa 与 sor 标准曲线绘制的方法，利用 hplc 法测定其中 oxa 与sor 的含量。所有测量一式三份。制备细胞摄取药物的曲线图（图9）。
42.6 结果从上述数据中可以看出，对比常规用药方式，采用 os
‑
icg
‑
β
‑
cd给药，具有明显优势，对正常肝组织细胞的毒副作用，以及对药液途径上的正常器官，其药液浓度及毒副作用都相比常规用药方式更低，对深层次肝癌细胞实现给药，给药深度提高。在体外评价中可以看出，icg
‑
β
‑
cd对人肝癌hepg2 细胞杀伤效果更好，细胞摄取率可以较长时间的维持在较高水平。